NGS样品制备指南之DNA
2015-11-17 12:37:26 点击：
在经历了几年的高速发展之后，新一代测序仪终于放慢了脚步。如今，样品制备成为NGS中新的亮点。新试剂、新仪器不断涌现，以缩短时间，提高通量。同时，新方法也在不断被开发，以处理更少的样本，如单细胞。这一次，生物通带您走近NGS的样品制备，看看有哪些新工具能帮助我们应对样品制备的挑战。
首先，我们从DNA的样品制备说起。制备NGS文库需要先提取基因组DNA；将其片段化，通过凝胶电泳或磁珠选择合适大小的片段；对DNA进行末端修复，对5’端磷酸化，并在其3’端加上适当的接头；并定量最终的文库。
片段化
DNA片段化主要是通过物理方法（如超声剪切）或酶学方法（即非特异的核酸内切酶处理）来实现的。美国斯克里普斯研究所的Steven Head曾在《BioTechniques》杂志上发表文章，介绍NGS文库制备的现状与挑战1。据介绍，他们实验室是采用Covaris的仪器进行超声剪切。同时，Covaris超声破碎系统也是各大测序仪制造商在操作手册中大力推荐的。
Covaris样品制备是基于专利的Adaptive Focused Acoustic（AFA）技术。它利用几何聚焦声波能量，通过>400kHz的球面固态超声传感器将波长为1mm的声波能量聚焦在样品上。这个过程是在等温的条件下进行的，确保了核酸样品的完整性得以保留，并能实现高的回收率。Covaris的仪器有多个系列，包括经济的M系列，单管全功率的S系列以及更高通量的E和L系列。
配合专门设计的AFA管，Covaris仪器可精确地将DNA和RNA打断成100-1500 bp片段（microTUBE），或2-5 kb片段（miniTUBE）。对于那些需要更长DNA片段的测序应用，Covaris还开发出专利的g-TUBE™。这种管通过离心产生剪切力，能产生6-20 kb的片段。
当然，酶切的方法也是个简单易行的好选择。我们可用DNase I来消化DNA片段。NEB公司也推出了NEBNext dsDNA Fragmentase，能产生100-800 bp的片段。它是两种酶的混合物：一种在dsDNA上产生随机切刻，另一种识别切刻位点，切割对面的DNA链，产生双链DNA断裂。dsDNA Fragmentase可用于基因组DNA、PCR产物和全基因组扩增DNA，而无论其GC含量如何。之前的研究证实，酶切法和超声法都很高效，不过Fragmentase酶切法产生了较多的artifactual indels。
Illumina的Nextera技术也是一种酶学方法。它利用一种转座酶，能同时完成DNA片段化和接头的添加，从而减少样品处理，并节约时间。据介绍，利用Nextera DNA样品制备试剂盒，测序即用型文库可在90分钟内产生，且手动操作仅需15分钟。更吸引人的是，Nextera支持50 ng的样品，而Nextera XT更是支持几纳克的样品。
大小选择（Size Selection）
对于片段后的大小选择，大家通常使用贝克曼库尔特家的AMPure XP磁珠。不过如果样品质量不高（如FFPE），最好还是用凝胶电泳。凝胶电泳的优点是便宜，非常严格的选择，但不容易自动化。在点样时应特别小心，避免过量和交叉污染。对于电泳时的标准品，Illumina建议使用Promega的BenchTop 100 bp DNA ladder，因为它产生漂亮而锐利的条带。
文库制备
目前市场上有多家公司提供文库制备的试剂盒。竞争使得价格不断下降，而质量不断上市。这些试剂盒能从微克至皮克级的起始材料开始制备文库。不过，大家要记住一点，起始材料越多，意味着扩增越少，文库复杂性越好。
Illumina公司之前提供TruSeq DNA Sample Preparation Kit。不过此试剂盒现在已停产，取而代之的是TruSeq DNA PCR-Free Sample Prep和TruSeq Nano DNA Sample Prep。TruSeq DNA PCR-free通过去除PCR步骤，并以磁珠选择取代凝胶选择，简化了样品制备的流程。它带来了出色的覆盖度质量，并显著减少了文库偏向和覆盖度缺口。此试剂盒提供两种操作，可产生大的（550 bp）或小的（350 bp）的插入片段，支持各种应用。
TruSeq Nano DNA Sample Prep Kit则顾名思义，需要较少的起始材料。一般试剂盒需要~1 μg的DNA，而TruSeq Nano DNA只需要100-200 ng DNA。这样，即使样本量很少，比如肿瘤样本，也能开展测序研究。TruSeq试剂盒都有高通量（HT）和低通量（LT）版本可供选择，包含试剂、样品纯化磁珠和索引。
NEB公司也推出了30多款样品制备方面的产品（NEBNext系列），适合Illumina、454、Ion Torrent等多个平台。NEBNext DNA Sample Prep Master Mix Set for Illumina 是一款文库制备产品，适用于后续的定向富集或在Illumina的HiSeq或MiSeq平台上直接测序。试剂盒中包含了末端修复、加A尾和接头连接所需的全部试剂。不过，接头需要单独购买。
此外，NEB新推出了NEBNext Ultra™ DNA Library Prep Kit。它不仅适用于少量样本（低至5 ng），还能够处理福尔马林固定、石蜡包埋的FFPE组织。这个快速的流程可在3小时内完成，且手工操作时间极少。试剂盒中采用高保真性的PCR酶，以减少GC偏向。
当然，对于外显子组测序、ChIP-Seq等实验而言，还需要一些特定的富集或扩增步骤，但大致流程是相似的，目标也一致，就是让测序文库尽可能的复杂。那么，我们就要尽量避免扩增反应（如PCR）所引入的偏向。大家都知道，GC含量对PCR扩增效率有很大影响。Steven Head建议大家在扩增时使用Kapa HiFi（Kapa Biosystems）或AccuPrime Taq DNA Polymerase High Fidelity（Life Technologies）。他认为，这些酶能大幅减少极端GC含量所导致的扩增偏向。
单细胞测序
对于大家感兴趣的单细胞基因组测序，目前的策略是通过多重置换扩增（MDA）来实现全基因组的扩增，例如QIAGEN的新品REPLI-g Single Cell Kit。此试剂盒采用优化配方的高保真Phi 29聚合酶，能确保基因座的均匀扩增。同时，它还使用专门的缓冲液和试剂，并引入UV去污染步骤，能消除任何可检测到的残留DNA污染，确保高质量结果仅仅来自您那个宝贵的细胞。
此外，Fluidigm公司也在去年底为单细胞DNA测序推出了通用的样品制备方案，它可在C1™单细胞自动制备系统上运行。这一方案包括C1 IFC 芯片，C1试剂盒和验证过的程序，而且借力GE illustra GenomiPhi V2 DNA扩增试剂盒进行全基因组扩增。利用这一方案，研究人员可从单个细胞分离和制备可直接用于测序的文库，在不到一天的时间内平行处理和分析96个单细胞。
参考文献
1. Head SR, Komori HK, Lamere SA, et al. Library construction for next-generation sequencing: Overviews and challenges. Biotechniques. 2014 Feb 1;56(2):61-77.
首先，我们从DNA的样品制备说起。制备NGS文库需要先提取基因组DNA；将其片段化，通过凝胶电泳或磁珠选择合适大小的片段；对DNA进行末端修复，对5’端磷酸化，并在其3’端加上适当的接头；并定量最终的文库。
片段化
DNA片段化主要是通过物理方法（如超声剪切）或酶学方法（即非特异的核酸内切酶处理）来实现的。美国斯克里普斯研究所的Steven Head曾在《BioTechniques》杂志上发表文章，介绍NGS文库制备的现状与挑战1。据介绍，他们实验室是采用Covaris的仪器进行超声剪切。同时，Covaris超声破碎系统也是各大测序仪制造商在操作手册中大力推荐的。
Covaris样品制备是基于专利的Adaptive Focused Acoustic（AFA）技术。它利用几何聚焦声波能量，通过>400kHz的球面固态超声传感器将波长为1mm的声波能量聚焦在样品上。这个过程是在等温的条件下进行的，确保了核酸样品的完整性得以保留，并能实现高的回收率。Covaris的仪器有多个系列，包括经济的M系列，单管全功率的S系列以及更高通量的E和L系列。
配合专门设计的AFA管，Covaris仪器可精确地将DNA和RNA打断成100-1500 bp片段（microTUBE），或2-5 kb片段（miniTUBE）。对于那些需要更长DNA片段的测序应用，Covaris还开发出专利的g-TUBE™。这种管通过离心产生剪切力，能产生6-20 kb的片段。
当然，酶切的方法也是个简单易行的好选择。我们可用DNase I来消化DNA片段。NEB公司也推出了NEBNext dsDNA Fragmentase，能产生100-800 bp的片段。它是两种酶的混合物：一种在dsDNA上产生随机切刻，另一种识别切刻位点，切割对面的DNA链，产生双链DNA断裂。dsDNA Fragmentase可用于基因组DNA、PCR产物和全基因组扩增DNA，而无论其GC含量如何。之前的研究证实，酶切法和超声法都很高效，不过Fragmentase酶切法产生了较多的artifactual indels。
Illumina的Nextera技术也是一种酶学方法。它利用一种转座酶，能同时完成DNA片段化和接头的添加，从而减少样品处理，并节约时间。据介绍，利用Nextera DNA样品制备试剂盒，测序即用型文库可在90分钟内产生，且手动操作仅需15分钟。更吸引人的是，Nextera支持50 ng的样品，而Nextera XT更是支持几纳克的样品。
大小选择（Size Selection）
对于片段后的大小选择，大家通常使用贝克曼库尔特家的AMPure XP磁珠。不过如果样品质量不高（如FFPE），最好还是用凝胶电泳。凝胶电泳的优点是便宜，非常严格的选择，但不容易自动化。在点样时应特别小心，避免过量和交叉污染。对于电泳时的标准品，Illumina建议使用Promega的BenchTop 100 bp DNA ladder，因为它产生漂亮而锐利的条带。
文库制备
目前市场上有多家公司提供文库制备的试剂盒。竞争使得价格不断下降，而质量不断上市。这些试剂盒能从微克至皮克级的起始材料开始制备文库。不过，大家要记住一点，起始材料越多，意味着扩增越少，文库复杂性越好。
Illumina公司之前提供TruSeq DNA Sample Preparation Kit。不过此试剂盒现在已停产，取而代之的是TruSeq DNA PCR-Free Sample Prep和TruSeq Nano DNA Sample Prep。TruSeq DNA PCR-free通过去除PCR步骤，并以磁珠选择取代凝胶选择，简化了样品制备的流程。它带来了出色的覆盖度质量，并显著减少了文库偏向和覆盖度缺口。此试剂盒提供两种操作，可产生大的（550 bp）或小的（350 bp）的插入片段，支持各种应用。
TruSeq Nano DNA Sample Prep Kit则顾名思义，需要较少的起始材料。一般试剂盒需要~1 μg的DNA，而TruSeq Nano DNA只需要100-200 ng DNA。这样，即使样本量很少，比如肿瘤样本，也能开展测序研究。TruSeq试剂盒都有高通量（HT）和低通量（LT）版本可供选择，包含试剂、样品纯化磁珠和索引。
NEB公司也推出了30多款样品制备方面的产品（NEBNext系列），适合Illumina、454、Ion Torrent等多个平台。NEBNext DNA Sample Prep Master Mix Set for Illumina 是一款文库制备产品，适用于后续的定向富集或在Illumina的HiSeq或MiSeq平台上直接测序。试剂盒中包含了末端修复、加A尾和接头连接所需的全部试剂。不过，接头需要单独购买。
此外，NEB新推出了NEBNext Ultra™ DNA Library Prep Kit。它不仅适用于少量样本（低至5 ng），还能够处理福尔马林固定、石蜡包埋的FFPE组织。这个快速的流程可在3小时内完成，且手工操作时间极少。试剂盒中采用高保真性的PCR酶，以减少GC偏向。
当然，对于外显子组测序、ChIP-Seq等实验而言，还需要一些特定的富集或扩增步骤，但大致流程是相似的，目标也一致，就是让测序文库尽可能的复杂。那么，我们就要尽量避免扩增反应（如PCR）所引入的偏向。大家都知道，GC含量对PCR扩增效率有很大影响。Steven Head建议大家在扩增时使用Kapa HiFi（Kapa Biosystems）或AccuPrime Taq DNA Polymerase High Fidelity（Life Technologies）。他认为，这些酶能大幅减少极端GC含量所导致的扩增偏向。
单细胞测序
对于大家感兴趣的单细胞基因组测序，目前的策略是通过多重置换扩增（MDA）来实现全基因组的扩增，例如QIAGEN的新品REPLI-g Single Cell Kit。此试剂盒采用优化配方的高保真Phi 29聚合酶，能确保基因座的均匀扩增。同时，它还使用专门的缓冲液和试剂，并引入UV去污染步骤，能消除任何可检测到的残留DNA污染，确保高质量结果仅仅来自您那个宝贵的细胞。
此外，Fluidigm公司也在去年底为单细胞DNA测序推出了通用的样品制备方案，它可在C1™单细胞自动制备系统上运行。这一方案包括C1 IFC 芯片，C1试剂盒和验证过的程序，而且借力GE illustra GenomiPhi V2 DNA扩增试剂盒进行全基因组扩增。利用这一方案，研究人员可从单个细胞分离和制备可直接用于测序的文库，在不到一天的时间内平行处理和分析96个单细胞。
参考文献
1. Head SR, Komori HK, Lamere SA, et al. Library construction for next-generation sequencing: Overviews and challenges. Biotechniques. 2014 Feb 1;56(2):61-77.
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