一、   实验流程

羧基磁珠偶联带伯氨基的生物配体主要包括以下3个步骤：

1.磁珠表面羧基活化；

2.生物配体偶联；

3.活性基团淬灭。

二、   实验步骤

1.溶液配制

（1）MES溶液配制（100mM MES，pH 5.0~5.3，250mL）

a. 配0.2M MES溶液: MES（2-(N-吗啉代)乙烷磺酸）8.53g+去离子水 200ml；

b. 配0.1M NaOH溶液:NaOH 0.4g+去离子水 100ml；

c. 取125ml 0.2M MES溶液，然后用0.1M氢氧化钠调节pH为5.0~5.3，最后用纯化水定容到250ml。

（2）生物配体溶液的配制（预先配制，然后保存在4℃）

称取500μg生物配体溶解在1mL PBS（0.05M，pH=8.0~8.3）溶液中，充分溶解，备用。（生物配体的浓度对偶联很重要，此处可以设置不同的浓度梯度）

（3）Blocking Buffer配制（0.5M乙醇胺，0.5M氯化钠，pH=8.4~8.6，100mL）

分析天平称取3.1g乙醇胺、2.93g氯化钠于烧杯中，加50mL纯化水溶解，然后调节pH=8.4~8.6，最后定容到100mL。

2.磁珠表面羧基活化

a. 混匀磁珠后，取1mL（10mg/mL）Mag COOH磁珠到15mL离心管中，并放置在磁分离架上直到上清液变澄清，用吸管小心移弃上清；

b. 移取5mL0.1M的MES溶液于上述离心管中，漩涡振荡30s，将离心管放置在磁分离架上直到上清液变澄清，用吸管小心移弃上清；

c. 重复步骤b三次，最后一次洗涤后重悬磁珠于2mL0.1M的MES溶液中；

d. 用分析天平依次称取0.04g EDC.HCl（1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐）和0.024gNHS（N-羟基琥珀酰亚胺）加入c中离心管中；

e．剧烈振荡摇匀；

f．室温下，将离心管置于旋转混匀仪上活化反应 30 min。反应过程中，注意不让磁珠沉淀聚积在一起。（活化反应时间不能超过30min）

g. 反应结束后，将离心管放在磁分离架上直到上清液变清，用吸管小心移弃上清；

h. 重复步骤b四次，磁吸去上清液后，备用。

3．羧基活化磁珠与生物配体的共价偶联

a. 迅速加入1mL预先配制的生物配体溶液，振荡摇匀；

b.25℃，将离心管置于旋转混匀仪上偶联反应2小时（或4℃反应过夜）。

c. 反应结束后，将离心管置于磁分离架上磁性分离去除上清液；

d. 加入2mL blocking Buffer，振荡混匀后，25℃，将离心管置于旋转混匀仪上反应30min；

e. 将离心管置于磁性分离器上磁性分离去除上清液；

f.移取2mL PBS溶液（pH 7.2）或保存溶液于离心管中，漩涡振荡30s；g. 重复步骤f 4次；

h．洗涤后，将其重悬于保存液中，保存于4 C。如果固定的生物配体稳定，可以在保存溶液中加入0.02%（W/V）叠氮化钠作为抑菌剂，以便长期保存。